PI3K/Akt信号通路及SP1在VEGF上调胃癌细胞MRP1中的作用
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【摘 要】目的:从多药耐药相关蛋白1(multidrug resistanceassociated protein 1,MRP1)基因转录调控入手,初步探讨血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)上调MRP1表达的机制.方法:(1)以人胃癌BGC-823细胞为模型,一组常规培养24 h,另一组VEGF作用24 h,最后一组PI3K/Akt抑制剂LY294002预处理1 h后再加VEGF作用24 h,Western blot法分别检测各实验组MRP1、Akt、p-Akt及SP1蛋白表达水平,EMSA方法检测各实验组转录因子SP1与D NA的结合活性;(2)构建分别含MRP1基因启动子序列及SP1结合位点突变的MRP1基因启动子序列的重组荧光素酶报告基因载体(PGL3-Basic-MRP1w、PGL3-Basic-MRP1m),荧光素酶活性分析突变后的MRP1基因启动子在BGC-823细胞中活性的改变及VEGF对其转录活性的影响.结果:(1)VEGF 32 ng/mL作用24 h组与未处理组相比,MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均上调,且SP1的DNA结合活性明显增强;LY294002 50μmol/m L预处理1 h再联合VEGF32 ng/m L作用24 h后,与VEGF 32 ng/m L单独作用组相比,MRP1、p-Akt、SP1在蛋白水平均下调,SP1的DNA结合活性明显减弱;(2)在BGC-823细胞中,PGL3-Basic-MRP1m具有启动子活性(110.000±2.603),其转录活性为空载体PGL3-Basic的1.8倍(t=-8.936,P〈0.01),但与SP1结合位点突变之前的MRP1启动子(PGL3-Basic-MRP1w)活性(144.000±6.888)相比,其转录活性下降23.6%(t=4.617,P〈0.05);VEGF作用12 h后,其活性增强,且呈剂量依赖关系(r=0.911,P〈0.01),VEGF作用浓度为32 ng/m L时达最大值(191.000±14.799),与无VEGF作用组(112.000±11.358)相比,活性增高0.7倍(t=-7.335,P〈0.01);VEGF作用24 h后,也能以剂量依赖的方式上调SP1结合位点突变后MRP1启动子区的转录活性(r=0.945,P〈0.01),与无VEGF作用组(133.000±6.083)相比,最大活性(426.000±7.000)增高2.2倍(t=-56.032,P〈0.01).结论:VEGF对MRP1启动子活性的上调作用与激活PI3K/Akt信号通路及增�
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